Interpretazione della patologia clinica nei cani e nei primati non umani negli studi preclinici

Cani eprimati non umani (NHP), in particolare i cani Beagle e i macachi cynomolgus o rhesus, sono modelli animali di grandi dimensioni essenziali nello sviluppo preclinico di farmaci. Le loro somiglianze fisiologiche con gli esseri umani forniscono un valore traslazionale per la valutazione della sicurezza, della farmacologia e dei biomarcatori.

A differenza dei roditori, gli animali di grandi dimensioni accettano prelievi di sangue ripetuti e volumi di campione maggiori, consentendo l'esecuzione simultaneafarmacocinetica (PK), tossicocinetico (TK)e valutazioni di patologia clinica. Tuttavia, l’interpretazione dei dati di patologia clinica in queste specie è confusa dalla variabilità biologica, dal disegno dello studio, dall’origine animale e dalle procedure sperimentali. Per distinguere la vera tossicità correlata all'articolo di prova-dalla deriva fisiologica o dagli artefatti procedurali è necessaria una comprensione completa di queste variabili.

Negli studi su animali di grandi dimensioni, le dimensioni delle coorti sono intrinsecamente limitate a causa di vincoli etici e pratici. Di conseguenza, i dati di riferimento pre{1}}dose sono fondamentali. L'esecuzione di più valutazioni pre-dose consente agli investigatori di:

• Stabilire ogni animale come proprio controllo longitudinale.
• Quantificare la variabilità biologica individuale.
• Identificare ed escludere valori anomali o animali non sani prima della randomizzazione.
• Differenziare la gestione-delle risposte allo stress indotto dalla fisiologia di base.

La variazione individuale è particolarmente pronunciata nei NHP rispetto ai roditori o ai cani allevati appositamente-. Le anomalie basali spesso includono parametri eritrocitari fluttuanti, aumenti sporadici degli enzimi epatici o profili proteici atipici. Se queste variazioni di base si sovrappongono al target farmacologico previsto o al profilo tossicologico dell'articolo in esame, lo screening pre-dose funge da meccanismo principale per prevenire interpretazioni false-positive.

Prelievi frequenti per il profilo farmacocinetico possono indurre alterazioni ematologiche iatrogene. Il prelievo di sangue ad alta-frequenza o-volume elevato causa spesso una diminuzione di:

• Conta dei globuli rossi (RBC).
• Concentrazione di emoglobina (Hgb).
• Ematocrito (Hct)
• Proteine ​​totali e albumina (a causa dell'emodiluizione)

Se la funzione del midollo osseo rimane intatta, questi cambiamenti microcitici o normocitici sono tipicamente accompagnati da una reticolocitosi compensatoria. Pertanto, i lievi cali dei parametri eritronici devono essere confrontati-con i volumi totali di sangue prelevati durante lo studio.

I protocolli NHP richiedono abitualmente l'anestesia per la contenzione, l'imaging o il campionamento invasivo. La scelta e la durata dell'anestesia influiscono direttamente sulle letture della patologia clinica. Gli animali anestetizzati mostrano frequentemente distribuzioni leucocitarie alterate e profili elettrolitici spostati rispetto a gruppi coscienti e trattenuti manualmente. Inoltre, la posizione sdraiata e le iniezioni anestetiche intramuscolari possono causare traumi muscolari subclinici, portando a picchi marcati della creatina chinasi (CK). Tecniche di campionamento coerenti e protocolli anestetici standardizzati sono obbligatori in tutte le fasi dello studio.

Ulteriori variabili di progettazione dello studio che richiedono un controllo rigoroso includono:

• Età degli animali e stadio di sviluppo
• Durata del digiuno e tempistica relativa alla raccolta
• Ordine di campionamento all'interno di una coorte
• Via e velocità di somministrazione
• Procedure sperimentali complesse (p. es., dosaggio chirurgico, infusioni continue)

Cani e NHP possiedono una durata di vita degli eritrociti più lunga rispetto ai roditori, alterando la cinetica dello sviluppo dell'anemia e del recupero del midollo. A seguito di una perdita ematica acuta, gli animali di grandi dimensioni mostrano una percentuale di reticolociti basale inferiore e una risposta rigenerativa più graduale.

Nei macachi, le caratteristiche basali degli eritrociti (come il volume corpuscolare medio) sono correlate all'origine geografica (p. es., scimmie cynomolgus cinesi vs cambogiane vs mauriziane). L'utilizzo di animali provenienti da un'unica fonte geografica riduce al minimo il rumore di base. Inoltre, i patogeni di fondo subclinici (come emoparassiti o infezioni virali latenti) possono sopprimere l’eritropoiesi e devono essere selezionati durante la quarantena.

I profili dei leucociti sono altamente specie-specifici. I cani sono a dominanza dei neutrofili-, mentre i cani NHP sani mostrano una distribuzione più equilibrata o a dominanza dei linfociti-. Queste differenze di base determinano modelli di manifestazione distinti durante l’infiammazione sistemica.

Inoltre, la contenzione fisica, nuovi ambienti o la paura innescano un rapido rilascio di catecolamine e glucocorticoidi. Questa risposta allo stress induce la mobilizzazione del pool marginale, presentandosi come neutrofilia e linfopenia transitorie. Poiché i NHP sono altamente sensibili alla gestione dello stress, variazioni isolate nella conta dei globuli bianchi-in assenza di segni clinici correlati o evidenza istopatologica di infiammazione dei tessuti-dovrebbero essere interpretate con cautela.

La cinetica della coagulazione varia a seconda della specie. Il tempo di protrombina (PT) basale è intrinsecamente più breve nei cani che negli esseri umani e le carenze di fattori idiosincratici possono causare un prolungamento del PT isolato e non-correlato al farmaco-in singoli cani. Negli studi NHP, i test del tempo di tromboplastina parziale attivata (APTT) sono altamente sensibili alla variabilità del lotto di reagenti e alla manipolazione del campione (ad esempio, coagulazione parziale durante la raccolta). Quando la cascata della coagulazione è un bersaglio noto dell'articolo in esame, sono fondamentali una stretta corrispondenza della linea di base e lotti di reagenti uniformi.

L’alanina aminotransferasi (ALT) è un biomarker standard per la perdita epatocellulare. Nei cani Beagle giovani-allevati appositamente, gli intervalli di ALT di base sono ristretti, consentendo il rilevamento di sottili cambiamenti epatici-indotti dal trattamento. Al contrario, i cani più anziani e gli NHP mostrano una variazione fisiologica più ampia.

I macachi presentano frequentemente picchi di ALT transitori e autolimitanti dovuti a cambiamenti epatici di fondo o a riacutizzazioni virali subcliniche. Di conseguenza, gli aumenti di singoli-punti negli enzimi epatici richiedono la conferma tramite biomarcatori concorrenti (ad esempio, aspartato aminotransferasi, acidi biliari totali), test funzionali e valutazioni istopatologiche.

La fosfatasi alcalina (ALP) e la gamma-glutamil transferasi (GGT) servono come indicatori di malattia epatobiliare o colestatica. Mentre l'ALP è altamente sensibile alla colestasi nei cani, è meno specifica nei NHP a causa dei significativi contributi degli isoenzimi ossei e intestinali, in particolare negli animali giovani in crescita. La GGT è spesso un marcatore biliare più affidabile nei modelli NHP.

L'azoto ureico nel sangue (BUN) e la creatinina sierica rimangono gli indicatori standard della filtrazione glomerulare, nonostante la loro insensibilità all'insufficienza renale allo stadio iniziale-. I cani mantengono intervalli fisiologici relativamente ristretti per questi analiti, semplificando l’identificazione di lievi alterazioni renali. Al contrario, i NHP presentano un ampio range di base, rendendo più difficile caratterizzare i cambiamenti sottili.

Poiché il BUN è influenzato dal catabolismo proteico, dall’assunzione alimentare e dallo stato di idratazione, deve essere interpretato insieme alla creatinina. L'analisi delle urine fornisce un contesto essenziale, ma la raccolta dei campioni negli animali di grandi dimensioni-che spesso comporta la raccolta durante la notte-introduce rischi di evaporazione, contaminazione fecale o degradazione cellulare. Quando la nefrotossicità è una preoccupazione primaria, si consiglia la cistoscopia cronometrata-guidata dagli ultrasuoni o il caging metabolico specializzato.

Gli aumenti della creatina chinasi (CK) sono comuni negli studi NHP. Sono spesso guidati dalla cattura fisica, dalla contenzione, dalle iniezioni intramuscolari o dalla decubito prolungato sotto anestesia piuttosto che dalla tossicità sistemica dell'oggetto in esame. Per evitare interpretazioni errate, i picchi isolati di CK dovrebbero essere valutati rispetto a:

• Prossimità cronologica ad eventi stressanti o iniezioni
• Chiara dipendenza dalla dose-tra i gruppi di trattamento
• Co-attivazione di marcatori tissutali più specifici
• Cambiamenti simultanei nell'aspartato aminotransferasi (AST) e nella lattato deidrogenasi (LDH)

Per le valutazioni della cardiotossicità, dovrebbero essere utilizzate le troponine cardiache (I o T), poiché offrono una cardiospecificità superiore rispetto ai tradizionali marcatori enzimatici sia nei cani che nei NHP.

Il metabolismo del glucosio e dei lipidi nei NHP è altamente sensibile ai fattori di stress ambientale e ai cambiamenti nella dieta. La gestione del rilascio-indotto di adrenalina innesca abitualmente una rapida glicogenolisi, con conseguente iperglicemia transitoria. I programmi alimentari causano anche fluttuazioni pronunciate dei trigliceridi sierici e del colesterolo.

Gli NHP mostrano anche concentrazioni di proteine ​​sieriche basali più elevate e più variabili rispetto ai roditori. Le variazioni nelle frazioni di albumina e globulina spesso riflettono risposte infiammatorie non-specifiche della fase acuta-a procedure, infezioni subcliniche o stati nutrizionali alterati, piuttosto che una tossicità diretta sull'organo-bersaglio.

Le concentrazioni di elettroliti sierici, in particolare sodio, potassio e cloruro, sono soggette a rapidi cambiamenti nei NHP a causa dello stato di idratazione, degli squilibri acido-base dovuti alla depressione respiratoria indotta dall'anestesia-o all'emolisi del campione.

Le concentrazioni totali di calcio sono direttamente legate all’albumina sierica. Di conseguenza, le alterazioni del calcio totale devono essere corrette matematicamente o fisiologicamente per i livelli di albumina; i cambiamenti nel calcio totale non indicano necessariamente uno spostamento biologicamente rilevante nella frazione funzionale del calcio ionizzato.

L’interpretazione dei dati di patologia clinica nei cani e nei primati non umani va oltre i confronti statistici standard tra i gruppi veicolo e quelli di trattamento. La variabilità biologica, lo spostamento della linea di base, gli artefatti derivanti dal salasso, l'anestesia e lo stress da gestione spesso introducono dati confondenti.

Una valutazione accurata della sicurezza si basa sull'integrazione olistica dei parametri di patologia clinica con parametri di progettazione dello studio, osservazioni cliniche in tempo reale-, dati di esposizione farmacocinetica ed esiti istopatologici definitivi. Un approccio rigoroso e specifico per ogni specie a questi set di dati è essenziale per tradurre i risultati preclinici in valutazioni accurate del rischio umano.

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Hall, RL e Everds, NE (2003). Fattori che influenzano l’interpretazione della patologia clinica dei primati canini e non umani.Patologia tossicologica, 31(1_suppl), 6-10. DOI: 10.1080/01926230390174878