Le malattie genetiche sono ancora una sfida globale, in quanto sono causate da mutazioni nei geni che influenzano le funzioni biologiche, i processi metabolici o la produzione di alcune proteine essenziali degli individui, portando a vari disturbi ereditari. I farmaci per la terapia genica sono un tipo di intervento terapeutico che prende di mira geni specifici, mirando a ripararli o modificarli e a fornire nuove istruzioni alle cellule per produrre proteine funzionali o intervenire nei difetti genetici che causano malattie.
I farmaci genici comuni includono principalmente DNA e RNA, dove il DNA può essere frammenti di geni o sequenze di geni con effetti terapeutici. Questi DNA vengono consegnati alle cellule per sostituire o integrare le funzioni geniche difettose o mancanti. L'RNA può essere RNA messaggero (mRNA), piccolo RNA interferente (siRNA) o oligonucleotidi antisenso (ASO), ecc., che possono essere utilizzati per modificare, inibire l'espressione di geni dannosi o ripristinare la funzione di geni specifici.
Tuttavia, sia il DNA che l'RNA affrontano molte sfide dall'ingresso nel corpo umano al raggiungimento delle cellule bersaglio. Poiché le sequenze geniche sono instabili nel tratto gastrointestinale, vengono solitamente somministrate tramite iniezione endovenosa o sottocutanea, ma nonostante ciò, la maggior parte delle sequenze geniche viene comunque degradata dalle abbondanti nucleasi nel corpo umano.
Quando una piccola quantità di farmaci genici residui raggiunge l'esterno delle cellule bersaglio, non può entrare nelle cellule perché le sequenze geniche sono grandi molecole con gruppi fosfato che trasportano cariche negative, mentre le membrane cellulari trasportano anche cariche negative. Quando due cariche negative si incontrano, i geni vengono respinti e non possono entrare nelle cellule. Pertanto, dobbiamo sviluppare metodi specifici di somministrazione di farmaci genici per prevenirne la degradazione in vivo e migliorare l'efficienza della penetrazione della membrana cellulare e consegnare sequenze di DNA o RNA alle cellule senza problemi.
Metodi di somministrazione dei farmaci genici
Gli attuali metodi comuni di somministrazione genica sono principalmente divisi in due categorie: somministrazione tramite vettore virale e somministrazione tramite vettore non virale. La somministrazione tramite vettore virale include principalmente virus adeno-associati (AAV) e lentivirus, ecc., che possono simulare il processo di infezione virale delle cellule ospiti e attraversare facilmente le barriere cellulari, ottenendo così un'elevata efficienza di somministrazione. Tuttavia, la somministrazione tramite vettore virale presenta anche dei problemi: in primo luogo, ha una capacità di confezionamento limitata, come la capacità di confezionamento massima dell'AAV di 4,7 kb, che non può fornire sequenze geniche più lunghe; in secondo luogo, i vettori virali possono causare gravi reazioni immunitarie, tra cui l'immunità cellulare e l'immunità umorale, ponendo dei rischi per le applicazioni cliniche. Rispetto a ciò, i vettori non virali hanno enormi vantaggi in termini di sicurezza e capacità di caricamento del farmaco.
Gli attuali vettori non virali comunemente utilizzati includono principalmente liposomi, polimeri, nanoparticelle, esosomi, ecc., tra cui i liposomi sono vescicole formate da molecole anfifiliche con diametri che vanno da 100 nm a 1 um. Sono composti principalmente da fosfolipidi, colesterolo, lipidi PEG e lipidi cationici. La struttura del doppio strato fosfolipidico è simile alle membrane cellulari e può entrare nelle cellule senza problemi tramite endocitosi. Inoltre, i liposomi possono anche modificare il PEG o anticorpi specifici sulle loro superfici per sfuggire alla clearance immunitaria del corpo mentre prendono di mira tessuti o cellule specifici. I liposomi cationici sono liposomi che contengono lipidi di sale di ammonio quaternario caricati positivamente, che possono legarsi meglio con farmaci di acido nucleico caricati negativamente e mantenere la stabilità del sistema di somministrazione. Pertanto, i liposomi sono uno dei comuni metodi di somministrazione di vettori non virali per farmaci genici.
Tuttavia, i liposomi tradizionali presentano anche alcuni problemi: innanzitutto, a causa dell'ampia ampiezza dei diametri dei liposomi, sebbene ciò possa garantire una sufficiente capacità di carico del farmaco, quando i liposomi attraversano il gap endoteliale vascolare (100-200nm), dimensioni troppo grandi ostacoleranno questo processo. Inoltre, dopo che i liposomi entrano nelle cellule tramite endocitosi e formano il sistema endosoma-lisosoma, i liposomi tradizionali non riescono a completare la fuga lisosomiale in tempo, con conseguente degradazione della maggior parte dei farmaci genici da parte dei lisosomi e incapacità di esercitare i propri effetti. Sulla base di queste carenze dei liposomi tradizionali nel fornire farmaci genici, sono state sviluppate nanoparticelle lipidiche (LNP) che sono diventate un importante metodo di somministrazione particolarmente adatto per la somministrazione di acidi nucleici a cellule e tessuti bersaglio.
Introduzione al sistema di trasporto LNP
Le nanoparticelle lipidiche (LNP) sono nanoparticelle composte da sostanze simili ai lipidi e un diametro generalmente compreso tra 10-200nm. Rispetto ai liposomi tradizionali, sono più piccole e più facili da attraversare attraverso gli spazi endoteliali vascolari. Inoltre, le LNP sono solitamente costituite da lipidi cationici/ionizzabili, fosfolipidi ausiliari, lipidi di polietilenglicole (PEG) e colesterolo. Tra questi, i fosfolipidi ausiliari e il colesterolo possono aumentare la stabilità delle LNP; i lipidi PEG aiutano ad aumentare il tempo di circolazione delle LNP in vivo e a ridurre le reazioni immunitarie. Questi componenti hanno funzioni simili ai liposomi tradizionali. La differenza sta nei lipidi cationici/ionizzabili, che sono anche l'area principale di protezione brevettuale per le LNP.
Come accennato in precedenza, i liposomi cationici possono mantenere efficacemente il legame con i farmaci a base di acidi nucleici e migliorare l'efficienza di somministrazione dei farmaci a base di acidi nucleici. Tuttavia, i liposomi cationici sono anche inclini al legame non specifico con proteine plasmatiche, globuli, ecc. a carica negativa nella circolazione corporea, causando l'aggregazione dei liposomi e venendo rapidamente eliminati dal corpo (l'emivita dei liposomi cationici in vivo è di soli 15 min).
Per risolvere questo problema, i ricercatori hanno sviluppato un nuovo tipo di materiale lipidico chiamato lipidi ionizzabili. I lipidi ionizzabili sono molto simili ai lipidi cationici nella struttura. Prendendo come esempi il comune lipide cationico DOTAP e il lipide ionizzabile DODAP, la differenza è che DOTAP è un sale di ammonio quaternario con una carica positiva, mentre DODAP è una struttura di ammina terziaria. La struttura di ammina terziaria può mantenere il pKa del lipide tra 6-7. Quando il pH è inferiore al pKa (in condizioni acide), i lipidi ionizzabili sono caricati positivamente.
Quando il pH è vicino a pKa (in condizioni neutre), i lipidi ionizzabili sono neutri. Questo design può risolvere in modo intelligente il problema riscontrato dai liposomi cationici: poiché il pH nella circolazione sanguigna è vicino alla neutralità, anche i lipidi ionizzabili sono neutri e il legame non specifico tra loro e le proteine plasmatiche o le cellule del sangue è significativamente ridotto, prolungando l'emivita. Inoltre, quando i lipidi ionizzabili LNP vengono assorbiti dalle cellule ed entrano nei lisosomi, i lipidi vengono ionizzati e caricati positivamente nell'ambiente lisosomiale con pH 5-6. I lipidi caricati positivamente si fondono facilmente con la membrana endosoma-lisosoma, consentendo ai liposomi di fuoriuscire nel citoplasma, dissociarsi e rilasciare acidi nucleici, esercitando così i loro effetti. In sintesi, la progettazione del sistema di trasporto LNP comporta l'ottimizzazione della composizione lipidica, delle dimensioni delle particelle, della carica superficiale e della stabilità per ottenere un'efficiente distribuzione genica.
Strategia di bioanalisi LCMS per farmaci genici confezionati in LNP
I farmaci genici confezionati in LNP sono costituiti principalmente da un guscio LNP e dal farmaco genico stesso. Il guscio LNP è costituito principalmente da componenti lipidici (i lipidi cationici/ionizzabili rappresentano circa il 30-50%, i lipidi PEG rappresentano circa il 2%, il colesterolo rappresenta circa il 20-50%, i fosfolipidi ausiliari rappresentano circa il 10-20%), mentre i farmaci genici sono costituiti principalmente da frammenti di sequenza genica (DNA, ASO, siRNA e miRNA, ecc.). Secondo le ultime normative di NMPA e FDA[14-15], per l'applicazione IND di farmaci per sistemi di somministrazione di farmaci come LNP, oltre a condurre studi farmacologici e farmacocinetici sul principio attivo (sequenza genica), sono anche richieste la sicurezza e la valutazione farmaceutica per i nuovi componenti lipidici che non sono stati utilizzati nei farmaci commercializzati nel sistema di somministrazione di farmaci, come i lipidi cationici/ionizzabili e i lipidi PEG con modifiche speciali in LNP.
La bioanalisi LCMS dei lipidi LNP si concentra sui lipidi cationici/ionizzabili e sui lipidi PEG. A causa delle differenze strutturali tra loro, il peso molecolare dei lipidi cationici/ionizzabili è generalmente entro 1 kDa, mentre il peso molecolare dei lipidi PEG può raggiungere 2~5 kDa dopo aver trasportato gruppi di modifica, con conseguenti grandi differenze nella ritenzione cromatografica e nella risposta alla spettrometria di massa tra loro. Considerando che il contenuto di lipidi cationici/ionizzabili in LNP è superiore a quello dei lipidi PEG, la differenza di risposta porta all'incapacità di unificare efficacemente i metodi di pretrattamento (selezione del solvente di estrazione, determinazione del fattore di diluizione) di entrambi. Inoltre, a causa della presenza di molti picchi interferenti attorno alla posizione del picco dei lipidi PEG, è spesso richiesto un gradiente di separazione della fase liquida più lungo per una separazione efficace, che non può garantire un'elevata efficienza di analisi. Pertanto, stabiliamo separatamente il metodo di rilevamento dei lipidi PEG nella bioanalisi. Allo stesso tempo, i lipidi cationici/ionizzabili e i lipidi PEG presentano anche difficoltà comuni nello sviluppo del metodo a causa dei loro componenti lipidici, come scarsa solubilità in acqua, instabilità nella matrice biologica, legame proteico che porta a un recupero superiore al limite, elevata interferenza e residuo di lipidi PEG, variazione della stabilità dei lipidi nella matrice del campione reale e difficoltà nella selezione dello standard interno.
