La terapia genica è un approccio promettente per trattare varie malattie genetiche fornendo geni terapeutici nelle cellule bersaglio. Tuttavia, la consegna del gene non è un compito banale, poiché richiede il superamento di diverse barriere biologiche, come il riconoscimento immunitario, l'assorbimento cellulare, la fuga endosomiale, l'ingresso nucleare e l'espressione genica. Per superare queste sfide, i ricercatori hanno sviluppato vari tipi di vettori di consegna genica, come vettori virali e non virali.
Tra i vettori virali, il virus adeno-associato (AAV) è uno dei veicoli di consegna genica più utilizzati e di successo. L'AAV è un piccolo virus senza involucro che può infettare sia le cellule in divisione che quelle non in divisione e può mediare l'espressione genica a lungo termine senza integrarsi nel genoma dell'ospite. L'AAV ha una bassa immunogenicità e un ampio tropismo, il che significa che può infettare vari tipi di cellule e tessuti. Inoltre, l'AAV può essere progettato per visualizzare diverse proteine o peptidi di superficie per migliorare la specificità e l'efficienza del targeting.
Tuttavia, AAV presenta anche alcune limitazioni, come una piccola capacità di confezionamento di circa 4,7 kb, un potenziale rischio di mutagenesi inserzionale e un'immunità preesistente in alcuni individui. Pertanto, i ricercatori esplorano costantemente nuovi modi per migliorare i vettori AAV per le applicazioni di terapia genica.
Una delle strategie per ottimizzare i vettori AAV consiste nell'utilizzare primati non umani (NHP) come modelli animali. Gli NHP sono strettamente correlati agli esseri umani in termini di fisiologia, anatomia, immunologia e genetica e quindi possono fornire dati più rilevanti e predittivi per gli studi di terapia genica umana. Gli NHP possono anche essere utilizzati per valutare la sicurezza, l'efficacia, la biodistribuzione e l'immunogenicità dei vettori AAV in vivo.
In questo post del blog, esamineremo alcuni dei recenti progressi nell'utilizzo di NHP come modelli per la terapia genica mediata da AAV. Ci concentreremo su tre aree principali: (1) sviluppo di nuovi sierotipi o varianti AAV con proprietà di trasduzione migliorate; (2) ingegnerizzare promotori tessuto-specifici o inducibili per controllare l'espressione genica; e (3) applicare la tecnologia CRISPR-Cas9 per ottenere un preciso editing del genoma con i vettori AAV.
Oltre a fornire geni sani per sostituire quelli difettosi, la terapia genica basata su AAV può essere utilizzata anche per raggiungere altri obiettivi, come migliorare l'espressione genica, silenziare l'espressione genica o modificare sequenze geniche. Per svolgere questi compiti, i ricercatori hanno sviluppato nuovi sierotipi o varianti AAV con proprietà di trasduzione migliorate, ingegnerizzando promotori specifici del tessuto o inducibili per controllare l'espressione genica e applicando la tecnologia CRISPR-Cas9 per ottenere un preciso editing del genoma con i vettori AAV.
Uno dei modi per migliorare l'efficienza e la specificità della trasduzione dell'AAV è progettare nuovi sierotipi o varianti dell'AAV che possano mirare meglio ai tipi di cellule desiderati ed eludere il sistema immunitario. Ad esempio, i ricercatori hanno utilizzato metodi di evoluzione diretta, progettazione razionale o visualizzazione dei peptidi per creare nuovi capsidi AAV che hanno migliorato il tropismo per alcuni tessuti, come il cervello, il fegato, il cuore o la retina. Alcuni di questi nuovi capsidi AAV hanno anche mostrato una ridotta immunogenicità e una maggiore stabilità rispetto ai sierotipi AAV naturali.
Un altro modo per migliorare la terapia genica AAV è progettare promotori tessuto-specifici o inducibili che possano regolare quando e dove viene espresso il transgene. Ad esempio, i ricercatori hanno utilizzato promotori attivati da determinati stimoli, come luce, temperatura o farmaci, per controllare i tempi e il livello dell'espressione del transgene. In alternativa, i ricercatori hanno utilizzato promotori specifici per determinati tipi di cellule, come neuroni, glia o fotorecettori, per limitare l'espressione del transgene alle cellule bersaglio. Queste strategie possono aiutare a ridurre gli effetti collaterali indesiderati e aumentare l'efficacia terapeutica della terapia genica AAV.
Un terzo modo per migliorare la terapia genica AAV è applicare la tecnologia CRISPR-Cas9 per ottenere un preciso editing del genoma con i vettori AAV. CRISPR-Cas9 è un potente strumento che può introdurre mutazioni mirate o correzioni nel genoma utilizzando un RNA guida (gRNA) e una nucleasi Cas9. I ricercatori hanno utilizzato i vettori AAV per fornire i componenti gRNA e Cas9 nelle cellule bersaglio e hanno raggiunto con successo l'editing del genoma in vari modelli animali di malattie umane. Ad esempio, i ricercatori hanno utilizzato AAV-CRISPR-Cas9 per correggere le mutazioni nei geni associati alla distrofia muscolare di Duchenne, alla fibrosi cistica, all'emofilia e alla retinite pigmentosa. Tuttavia, ci sono anche alcune sfide e limitazioni nell'utilizzo di AAV-CRISPR-Cas9, come effetti fuori bersaglio, risposte immunitarie e vincoli di confezionamento.
